【摘要】
南京大学现代工程与应用科学学院于涵洋课题组与姜硕星课题组合作，开发了酶催化非天然核酸合成的新方法，展示了该方法在保护DNA纳米结构免受核酸酶降解方面的应用。该文章以Enzymatic synthesis of TNA protects DNA nanostructures为题，发表在Angew. Chem. Int. Ed.期刊上。
图1 酶催化TNA合成，保护DNA纳米结构。
【背景】
非天然核酸含有人工的骨架或碱基结构。非天然核酸既能够用于存储和传递遗传信息、构建合成生命体，又能够作为功能分子结合靶标、催化反应1-5。苏糖核酸（TNA）是一种具有高生物稳定性的非天然核酸（图2）。研究者们前期已经通过体外筛选，获得了一系列具有识别或催化功能的TNA分子，为疾病的诊断和治疗提供了新型工具6-10。因此，TNA研究在生物医学等领域中具有重要的意义。
图2 TNA的化学结构。
TNA的深入研究依赖于工具酶的开发。然而，目前适用于TNA的工具酶种类非常少，无法实现TNA的酶催化从头合成。因此，作者尝试开发一种酶催化的TNA合成新方法：使用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）催化的反应，实现非模板依赖的TNA合成。其中，TdT是一种特殊的DNA聚合酶，能够以不依赖模板的方式催化单链DNA的合成。
【研究内容】
首先，作者用单链DNA作引物，用TNA的核苷三磷酸单体（tNTP）作底物，测试了TdT能否催化非模板依赖的TNA合成。结果显示，在TdT的催化下，4种tNTP均能被添加至DNA引物末端，延伸长度分布在+1~2（如tCTP）到+5~6（如tGTP）个碱基（图3）。
图3 TdT催化非模板依赖的TNA合成。
接着，鉴于TNA固有的高生物稳定性，作者探究了末端延伸了TNA的DNA是否具有更强的抗酶降解能力。结果显示，在外切酶的处理下，4种延伸产物均显示了比未保护DNA更高的稳定性（图4）。其中，tGTP延伸产物P-tG展现了最强的抗降解能力。
图4 TNA提高DNA抗核酸外切酶降解的能力。
基于上述结果，作者尝试利用TdT催化的tGTP延伸反应，通过一锅法，批量地制备高生物稳定性的DNA订书钉链。结果显示，在TdT的催化下，各组DNA订书钉链末端均成功发生了TNA的延伸（图5）。
图5 一锅法批量制备高生物稳定性的DNA订书钉链。
随后，作者将末端延伸了TNA的DNA订书钉链直接与DNA骨架链进行退火，成功地组装了TNA保护的DNA折纸纳米结构（DON-tG）。AFM图像显示， DON-tG具有与对照纳米结构相似的形貌（图6）。
图6 TNA延伸的DNA订书钉链可直接用于DNA纳米结构的自组装。
最后，为了探究DON-tG纳米结构的生物稳定性，作者测试了TNA保护的DNA纳米结构的稳定性。结果显示，DON-tG纳米结构在核酸外切酶溶液和胎牛血清中展现了更高的稳定性（图7）。
图7 TNA保护的DNA纳米结构在核酸外切酶溶液和FBS中稳定性更高。
【总结】
总之，该工作开发了非模板依赖的酶催化合成TNA的新方法，为TNA研究提供了新的工具酶。另一方面，该方法为提高DNA纳米结构的生物稳定性提供了新的策略。
【作者信息】
文章的第一作者是覃博荷和王琦，文章的通讯作者是于涵洋教授和姜硕星副教授，王宇昂、韩峰和王海燕对该工作亦有贡献。
【致谢】
这项工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金委、江苏省自然科学基金委的支持。
【原文链接】
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202317334
【参考文献】
(1) Pinheiro, V. B.; Taylor, A. I.; Cozens, C.; Abramov, M.; Renders, M.; et al. Synthetic Genetic Polymers Capable of Heredity and Evolution. Science2012, 336, 341-344.
(2) Malyshev, D. A.; Dhami, K.; Lavergne, T.; Chen, T.; Dai, N.; et al. A semi-synthetic organism with an expanded genetic alphabet. Nature2014, 509, 385-388.
(3) Taylor, A. I.; Pinheiro, V. B.; Smola, M. J.; Morgunov, A. S.; Peak-Chew, S.; et al. Catalysts from synthetic genetic polymers. Nature2015, 518, 427-430.
(4) Zhang, Y.; Ptacin, J. L.; Fischer, E. C.; Aerni, H. R.; Caffaro, C. E.; et al. A semi-synthetic organism that stores and retrieves increased genetic information. Nature2017, 551, 644-647.
(5) Hoshika, S.; Leal, N. A.; Kim, M. J.; Kim, M. S.; Karalkar, N. B.; et al. Hachimoji DNA and RNA: A genetic system with eight building blocks. Science2019, 363, 884-887.
(6) Schoning, K.; Scholz, P.; Guntha, S.; Wu, X.; Krishnamurthy, R.; et al. Chemical etiology of nucleic acid structure: the alpha-threofuranosyl-(3'-->2') oligonucleotide system. Science2000, 290, 1347-1351.
(7) Yu, H.; Zhang, S.; Chaput, J. C. Darwinian evolution of an alternative genetic system provides support for TNA as an RNA progenitor. Nat. Chem.2012, 4, 183-187.
(8) Wang, Y.; Wang, Y.; Song, D.; Sun, X.; Zhang, Z.; et al. A Threose Nucleic Acid Enzyme with RNA Ligase Activity. J. Am. Chem. Soc.2021, 143, 8154-8163.
(9) Wang, Y.; Wang, Y.; Song, D.; Sun, X.; Li, Z.; et al. An RNA-cleaving threose nucleic acid enzyme capable of single point mutation discrimination. Nat. Chem.2022, 14, 350-359.
(10) Li, X.; Zhang, Z.; Gao, F.; Ma, Y.; Wei, D.; et al. c-Myc-Targeting PROTAC Based on a TNA-DNA Bivalent Binder for Combination Therapy of Triple-Negative Breast Cancer. J. Am. Chem. Soc.2023, 145, 9334-9342.
